Expresión y Purificación de Proteínas y Complejos

La expresión y purificación de proteínas y complejos macromoleculares en cuanto a pureza y homogeneidad de la muestra es un paso fundamental que determina en gran parte el éxito de los subsiguientes experimentos de cristalización. Dentro de La Factoría podemos realizar la expresión de proteínas y complejos solubles, así como su purificación. Para ello disponemos de los siguientes equipos principales:

• HPLC (ÄKTApurifier™): Sistema de cromatografía líquida diseñado para separaciones rápidas y fiables de péptidos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos y proteínas. Puede ejecutar todas las técnicas a escalas desde μg a mg con tasas de flujo 0,001 m/min – 10 ml/min y presiones de 0-25 MPa. Incorpora muchas características para minimizar el tiempo de preparación y funcionamiento y maximizar la fiabilidad y reproducibilidad de los resultados. Además, permite la detección rayos UV en línea de hasta tres longitudes de onda simultáneamente (por ejemplo, 280/214/254 nm).

• FPLC (ÄKTA prime Plus™): Sistema de FPLC de bajas presiones (1 MPa máximo con el caudal de 0.1-50 ml/min), diseñado principalmente para la purificación de proteínas. Contiene un monitor UV (seleccionable a 254 y 280 nm), un medidor de conductividad (0.001-999.9 mS/cm), un mezclador e gradientes y un monitor de pH en línea. El sistema puede operar manualmente (en tiempo real) o con protocolos pre-programados o personalizados definidos por el usuario.

• Dynamic Light Scattering: El instrumento Zetasizer nano (Malvern Instruments) se puede utilizar para medir el tamaño de partícula, peso molecular y potencial zeta de las moléculas en solución, en un amplio intervalo de concentraciones con un control preciso de la temperatura para mediciones reproducibles, precisas y exactas.

• `Air-driven’ Ultracentrifuge: Centrífuga de mesa fácil de operar que alcanza una velocidad máxima (100.000 rpm) en tan sólo 30 segundos utilizando una cantidad muy pequeña muestra (tubos de capacidad máxima 150 µl).

• Protein purification columns: Una amplia gama de columnas de purificación de proteínas, incluyendo cromatografía de afinidad, desalting, intercambio iónico, resinas hidrófobas y de exclusión por tamaño.

• Biblioteca de plásmidos para expresión de proteínas heterólogas: Tenemos vectores bacterianos de expresión para la producción de proteínas heterólogas simples y complejos de proteínas a través de protocolos alternativos de expresión (plásmidos de expresión individuales y bi-y multi-vectores cistrónicos para las estrategias de co-expresión).

Servicios tecnológicos

Se pueden elegir 5 tipos principales de servicios que abarcan desde la simple producción de proteínas/complejos hasta su completa purificación para obtener una muestra homogénea.

1. Test Expresión Proteínas (sistemas procarióticos): Incluye la determinación de las mejores condiciones de expresión con cuantificación de fracción soluble y pellet, utilizando 27 condiciones (3 cepas E. coli x 3 conc. inductores x 3 Tª).

2. Purificación Proteínas y Complejos: Incluye la purificación de proteínas (muestra pura y homogénea) y complejos macromoleculares (muestra pura, homogénea y con buena estequiometría) mediante el uso de técnicas cromatográficas (afinidad, intercambio iónico, resinas hidrofóbicas o exclusión molecular). La purificación estándar incluye una columna de cromatografía; aunque de puede solicitar columnas adicionales.

3. Pack combinado de Expresión y Purificación: El pack combinado es el servicio más completo ya que incluye todos los pasos necesarios para la producción y purificación de la proteína o complejo desde 2 L de cultivo. Existen tres modalidades dependiendo del número de pasos de purificación: la expresión más un paso de purificación; con dos pasos de purificación; con tres pasos de purificación.

4. TEV Fusion Protein Cleavage: Eliminación de proteínas o colas de fusión.

5. Thermofluor: Búsqueda del buffer óptimo de solubilización.